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理化性质表征及其他服务

理化性质检测

概况

先导药物需要具有足够的目标特异性和疗效,但仅有这些性质是不够的。作为临床前开发研究的候选类药,化合物需要在分布、吸收和代谢等方面有足够的生物适应性。一些有药理活性的化合物,由于生物适应性不好、药效差或安全性差等在临床前筛选阶段被筛下来,而部分特征可以通过理化性质检测预测到。因此,理化性质检测被用于药物开发阶段来帮助区分先导化合物降低临床风险。解离常数(pKa)、溶解度和亲脂性是理化性质特征中较重要的部分,对于体内和体外类药性质的评估是必不可少的[1]。药明康德(WuXi  AppTec)的理化性质检测平台采用广泛应用的方法来进行这三种理化参数的检测(表1)。

表1. 药明康德理化性质检测常规方法

 

溶解度

溶解度是药物发现中重要的理化性质之一,在多种物理及生物过程如吸收、清除、剂型中扮演着重要的角色。化合物的溶解度被医药化学家分为几个等级,溶解度低于10 μg/mL的通常归为不溶,10-60 μg/mL的为有一定的溶解度,高于60 μg/mL的被认为是可溶的。区分动力学溶解度和热力学溶解度是非常重要的。

表2.  热力学溶解度和动力学溶解度的区别

发现科学家对溶解度的需求与开发科学家是不同的[2,3,4]。发现科学家要确保他们在用缓冲液稀释药物储备液的时候能够得到足够的检测浓度。因此,他们不必考虑化合物是非晶体还是亚稳晶型。药物开发阶段的目的是开发一个可行的药物制剂,并进行需要监管部门批准的详细的技术研究,从而充分表征原料药是必要的。药明康德的溶解度平台提供动力学溶解度和热力学溶解度测试,具体的溶解度测试类型取决于化合物的研究阶段。

 

动力学溶解度(KS)

实验方案

WuXi的动力学溶解度测试采用摇瓶法摇样,并用高效液相-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)进行分析。

表3.  动力学溶解度的实验方案

 

历史数据的重现性

卡马西平(Carbamazepine)和氯霉素(Chloramphenicol)被用作动力学溶解度的质控样品。产生的历史数据表现出良好的再现性(n=87),如图1。

图1.  质控样品动力学溶解度实验的历史数据统计(n=87)

 

热力学溶解度(TS)

实验方案

热力学溶解度的测定采用的是摇瓶法,并用高效液相-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)进行分析。

表4.  热力学溶解度的实验方案

历史数据的重现性

卡马西平和氯霉素被用作热力学溶解度的质控样品。实验中产生的数据表现出良好的再现性(n=30),如图2。

图2.  质控样品热力学溶解度实验的历史数据统计(n=30)

方法适用性验证

药明康德选用13个上市药品验证热力学实验的适用性。数据显示我们的实验值和文献值有良好的相关性,见图3。

图3.  WuXi热力学实验值(纵坐标)和文献值(横坐标)的相关性比较

 

解离常数(pKa)

化合物的解离常数(pKa)影响药物在体液中的存在方式,对解离常数(pKa)的认知和理解在药物的发现和开发阶段有重要的意义,有助于对药物的吸收和药物动力学等性质的预测。药明康德的pKa检测平台采用电位滴定法和分光光度法两种方法,使用Sirius T3仪器进行pKa的检测。电位滴定法或分光光度法的选择取决于一系列因素,包括:化合物的溶解度,可提供化合物的量,预测pKa的数值以及化合物的紫外吸收情况。

 

由于部分化合物水溶性较差,可以通过加入助溶剂来增加化合物的溶解性。通过在不同助溶剂比例下进行滴定,可以推导出水溶性差的化合物在水溶液中的pKa。

表5. 比较两种pKa检测方法

Sirius T3理化性质测量仪

历史重现性数据

盐酸奎宁pKa检测的历史数据具有良好的重现性(n=20),见图4.

   

图 4.  盐酸奎宁的pKa数据统计(n=20)           

方法适用性验证

为了证明方法可可靠性,对11种市售药物标准品进行检测,并与文献值进行对比,见图5.

图 5.  WuXi pKa实验值(纵坐标)和文献值(横坐标)的相关性比较

 

亲脂性(LogP和LogD)

化合物的亲脂性决定其分配系数,亲脂性是化合物优先在非极性脂介质中分配,而不在水相中分配的一种趋势。它对药物的其他大部分特征具有重要的决定作用,并是一种快速而有效的用于药性初步评估的工具,当口服药物通过被动扩散渗透时,一般认为中等LogP(范围0~3)的化合物的胃肠道吸收最佳,如图.6所示。在这一范围内,渗透性和溶解度存在良好的平衡。低LogP化合物的极性更高,较不容易渗透脂质双层膜;因此,这些化合物将需要足够小,并且优先非离子或阳离子的细胞旁路的吸收,利用自由扩散在肠腔摄取转运或胃肠外给药。而高LogP的化合物则非极性更高,因此,从溶解和溶解性以及表现出的脂类贮存效应的影响使其更难清理。对于那些离子化的化合物,水相的pH值会影响非离子药物形式的浓度,因此P具有pH依赖性。此方案通过在不同的pH下检测得到不同的分配系数(LogD)值,报告中需要注明对应pH值,而不像是的log P值是一个常数。

图6.  LogP影响系列化合物的口服生物利用度示例

在药明康德,LogP是通过按比例缩小的摇瓶法和用Sirius T3仪器的电位滴定法检测的。

表 6. LogP检测方法

按比例缩小摇瓶法

由于多数的药物(约80%)可离子化,LogP不能充分说明化合物在生理pH范围中的表现行为。但是LogD值是一个更有用的描述方式。由于LogD是依赖于pH的,当测定一个LogD值时,水相的pH应该总是固定的,最常用的是在pH=7.4 时所测定的LogD,脉管系统的生理pH。表7显示了在PH=7.4时不同的LogD值对药理性质的影响[7]

7.  LogD 7.4 对类药性的影响

试验方案

药明康德通过小型化正辛醇/缓冲液摇瓶法高通量检测在pH=7.4的 LogD值。首先将试验化合物溶解于二甲基亚砜(DMSO),然后将小体积样品溶液添加到含等比例的辛醇和缓冲液的样品管中中。密封样品管,进行震荡,让化合物充分的和两相进行混合。样品平衡后,分别转移整数体积的正辛醇相和缓冲液到含有稀释剂的新的2.2毫升容量板中。然后将样品溶液通过LC-MS/ MS进行分析,以获得LogD

表 8. LogD试验方案

 

历史数据重现

采用纳多洛尔,美西律,普萘洛尔,奎尼丁,阿米替林和氯丙嗪用作测定LogD实验的质量控制物质。重复试验表现出了良好的再现性(n=305),和文献值对比也有较好的相关性。

图7. WuXi实验所得平均数值(纵坐标)与文献值(横坐标)的相关性(n=305)

 

方法适用性验证

药明康德选择了27个市售药物标准品,用我们的log D测定系统进行检测(图8)。检测结果显示, log D平均值与文献数值具有良好的相关性。

图8. 27个市售化合物WuXi实验检测值(纵坐标)与文献值(横坐标)的相关性

通过LogD vs pH曲线得到LogP

对于离子化化合物,调节pH使化合物最大限度的以非电离形式存在溶液中,由于化合物分子倾向于分配在油相,将得到最大的分配系数。由于此时化合物在两项中都以非离子形式存在,在这个pH点Log D测量值等于的log P值。因此,LogD和pH值对应的最大值就是LogP,但只有当分子在pH值3-11范围内可以全部处于中性状态才可以检测得到。

 

代表数据

利用检测样品A和B所得的LogD vs pH 亲脂性曲线作为代表曲线。样品A是一个碱性化合物,因此提高pH值,有利于化合物去质子化,成为非离子状态。因此化合物分子在水溶液中离子化数量减少,有利于分配进入有机相。LogD值在pH值约为10左右,A已经完全呈中性分子状态,从而LogD等于LogP。对于酸性化合物B来说过程相似,表现情况与样品A相反。对于样品B,LogD值会随着pH值的降低而升高,因为在较低的pH值羧酸形式是优选的。因此,当pH值约为6.5时表明B被完全质子化从而LogD等于LogP。

图 9. 碱性化合物 log D vs pH 曲线.

图 10. 酸性化合物 log D vs pH 曲线.

 

电位滴定法(pH-metric方法)检测亲脂性

试验

在pH 2-12范围内对化合物进行滴定,得到化合物在水溶液中的滴定曲线,以及在正辛醇存在下的滴定曲线,通过由于被试化合物分配进入辛醇引起的滴定曲线的位移,计算亲脂性(图11)。Sirius T3软件可以根据化合物的LogP值以及pKa值描绘出LogD随pH的变化曲线。

 

图 11. 通过pH-metric 方法检测亲脂性

代表数据

图12是样品C的检测图谱,用于说明辛醇含量的增加对滴定的影响。检测过程中随着辛醇比例的增加pKa发生变化。Sirius T3软件根据辛醇(octanol)的比例推导出0% 辛醇中的poKa,从而计算出化合物的LogP值。

图 12. 样品C随辛醇比例的变化三次滴定的pKa曲线(离子强度调节水体积为 1.0mL)

 

参考文献:

  1. Yushen, G., Shen, H. pKa, Solubility, and Lipophilicity. Optimization in Drug Discovery, 1st ed. (Humana Press, 2004).
  2. Kerns, E. H., Li, D. Drug-like properties concepts, structure design and methods, 1st ed. (Academic Press, 2008).
  3. Venkatesh, S., Lipper, R. A. Role of the development scientist in compound lead selection and optimization. J Pharm Sci,

89, 145–154 (2000).

  1. Lipper, R. A. How can we optimize selection of drug development candidates from many compounds at the discovery

stage? Modern Drug Discovery, 2, 55–60 (1999).

  1. National Institutes of Health ChemIDplus database. http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ Retrieved September 2015.
  2. Box, K.J., Comer, J.E.A. Using Measured pKa LogP and solubility to investigate supersaturation and predict BCS Class. Curr

Drug Metab, 9, 869-878 (2008).

  1. Comer, J. E. A. Drug Bioavailability: Estimation of Solubility, Permeability, Absorption and Bioavalability. (Wiley-VCH, 2003).
  2. Avdeef, A. Absorption & Drug Development: Solubility, Pemeability, and Charge State. (John Wiley & Sons, 2003).
  3. Lombardo, F. et al. ELogD(oct): a tool for lipophilicity determination in drug discovery. 2. Basic and neutral compounds,

JMC, 44, 2490-2497 (2001).

  1. Sirius analytical. Introduction to pH-metric LogP measurement [powerpoint slides]. (2009).

 

 

 

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